Kill switch 디자인

[2sungwook]

https://benchling.com/s/seq-AVQOh5GpwDrWd3QHL4vs
QS 기반 kill switch 로 세포의 농도가 높은 상황에서는 MazE, MazF 모두 발현되지만, 세포의 농도가 낮으면 더 이상 MazE, MazF가 생산되지 않고 degrade 되는데 Antitoxin 이 더 빠르게 분해되어 세포는 죽는다.
MazE,F 동시 발현 후 시간에 따른 콜로니 감소: http://parts.igem.org/Part:BBa_K2292002
궁금한 점: MazE,F의 서열이 1bp overlap 하여 reading frame 이 다르다.

만약 toxin을 constitutive 하게 발현하고, antitoxin을 AHL 에 따라 발현하게 한다면 toxin은 얼마나 발현해야할까?

[igchoi]

@2sungwook 1. http://2017.igem.org/Team:CCU_Taiwan/Safety 2. https://2018.igem.org/Team:FJNU-China/Design 3. https://2020.igem.org/Team:XJTU-China/Contribution

[igchoi]

만약 toxin을 constitutive 하게 발현하고, antitoxin을 AHL 에 따라 발현하게 한다면 toxin은 얼마나 발현해야할까?

toxin의 안정성이 anti-toxin보다 높다면, anti-toxin을 상시발현하고, toxin을 유도발현하는것이 더 좋아보임.

[2sungwook]

넵, 조언 감사드립니다. 그런데 AHL에 따라 toxin을 발현하더라도 lux promoter 의 세기가 어느 정도인지 알 수 없어 Antitoxin을 어떤 세기의 상시발현 프로모터 하에 둘지가 고민입니다. 상시 발현 프로모터의 세기가 너무 세면 AHL이 있더라도 toxin의 양이 부족하여 효과가 없을 수 있을 것 같습니다. 여러 종류의 디자인을 만들어 wetlab으로 테스팅하거나, 미리 모델링을 해서 프로모터를 정해야할 것 같습니다.
이 자료를 Lux 모델링 자료로 참고중입니다: https://2019.igem.org/Team:Fudan/Model

[igchoi]

1. 디자인은 고민하되, 실제 제작은 가장 쉽고 빠른것으로 시도하세요. 2. Toxin-antiToxin관계는 문헌검토와 조금만 더 생각하면 됩니다. 이전 참고링크의 biosafety디자인은 빛/arabinose AND gate이니 그대로 이용해도 되고요. 3. 어떤 방식이든 지금 진행하는 것은 제생각에 'novelty'는 별로 없습니다. 어떤 점으로 biosafety grant를 받았는가에 다시한번 살펴보세요. 심사의견도 같이 받았었나요? 2021년 9월 9일 (목) 오후 6:01, 2sungwook ***@***.***>님이 작성:

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넵, 조언 감사드립니다. 그런데 AHL에 따라 toxin을 발현하더라도 lux promoter 의 세기가 어느 정도인지 알 수 없어 Antitoxin을 어떤 세기의 상시발현 프로모터 하에 둘지가 고민입니다. 상시 발현 프로모터의 세기가 너무 세면 AHL이 있더라도 toxin의 양이 부족하여 효과가 없을 수 있을 것 같습니다. 여러 종류의 디자인을 만들어 wetlab으로 테스팅하거나, 미리 모델링을 해서 프로모터를 정해야할 것 같습니다. 이 자료를 Lux 모델링 자료로 참고중입니다: https://2019.igem.org/Team:Fudan/Model — You are receiving this because you commented. Reply to this email directly, view it on GitHub <#23 (comment)>, or unsubscribe <https://github.com/notifications/unsubscribe-auth/ADNAUWS7VITZ62UCZPUK5H3UBBZWXANCNFSM5DUZ4BTQ> .

[2sungwook]

Grant 측에서의 피드백은 없었습니다. kill switch 자체의 novelty는 없지만 자료조사와 디자인까지는 진행한 Mucus adhesion 파트와 엮어서 wiki를 잘 작성하여 저희의 의도를 전달하겠습니다.
넵, 디자인해보니 크기가 크지 않아 한번에 합성해버려도 될 것 같습니다. 조교님께 한번 여쭤보고 빠르게 진행하겠습니다.
그리고 kill switch를 테스트 할 때 serial dilution 한 후 시간에 따른 세포 수 측정을 하면 좋을 것 같다고 생각을 하였습니다. 형광을 이용한 cell counting을 하면 좋을 것 같은데 이와 관련 하여 조금 찾아보겠습니다. 이와 관련하여 유용한 정보가 있으면 부탁드리겠습니다!
감사합니다.

[igchoi]

작년부터 Measurment는 폐지되었는데요.. 지금 보니 2019년 결과는 논문으로 나왔네요. KUAS도 포함되었는데, 어떤이유에서인지 두사람만 KUAS팀으로 이름이 올라가 있네요. 이런것도 제가 강조한 것처럼 팀리더가 확인하고 수정해야할 부분이에요. https://www.nature.com/articles/s42003-020-01127-5.pdf?origin=ppub 2021년 9월 9일 (목) 오후 6:11, IN-GEOL CHOI ***@***.***>님이 작성:

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1. 디자인은 고민하되, 실제 제작은 가장 쉽고 빠른것으로 시도하세요. 2. Toxin-antiToxin관계는 문헌검토와 조금만 더 생각하면 됩니다. 이전 참고링크의 biosafety디자인은 빛/arabinose AND gate이니 그대로 이용해도 되고요. 3. 어떤 방식이든 지금 진행하는 것은 제생각에 'novelty'는 별로 없습니다. 어떤 점으로 biosafety grant를 받았는가에 다시한번 살펴보세요. 심사의견도 같이 받았었나요? 2021년 9월 9일 (목) 오후 6:01, 2sungwook ***@***.***>님이 작성: > 넵, 조언 감사드립니다. 그런데 AHL에 따라 toxin을 발현하더라도 lux promoter 의 세기가 어느 정도인지 알 수 없어 > Antitoxin을 어떤 세기의 상시발현 프로모터 하에 둘지가 고민입니다. 상시 발현 프로모터의 세기가 너무 세면 AHL이 있더라도 > toxin의 양이 부족하여 효과가 없을 수 있을 것 같습니다. 여러 종류의 디자인을 만들어 wetlab으로 테스팅하거나, 미리 모델링을 > 해서 프로모터를 정해야할 것 같습니다. > 이 자료를 Lux 모델링 자료로 참고중입니다: https://2019.igem.org/Team:Fudan/Model > > — > You are receiving this because you commented. > Reply to this email directly, view it on GitHub > <#23 (comment)>, > or unsubscribe > <https://github.com/notifications/unsubscribe-auth/ADNAUWS7VITZ62UCZPUK5H3UBBZWXANCNFSM5DUZ4BTQ> > . >

[2sungwook]

좋은 자료 감사드립니다. 그럼 킬스위치 테스트를 위해 Cell counting 은 진행하는 것을 권장하시나요? 아니면 다른 testing 방식을 권장하시나요? 개인적으로는 cell counting 관련된 webinar도 igem 측에서 제공하여 진행하는 것이 나쁘지 않을 것 같습니다.

[igchoi]

직접 실험가능한 경우로 한정하세요. 시간여유가 별로 없습니다. 2021년 9월 9일 (목) 오후 6:30, 2sungwook ***@***.***>님이 작성:

좋은 자료 감사드립니다. 그럼 킬스위치 테스트를 위해 Cell counting 은 진행하는 것을 권장하시나요? 아니면 다른 testing 방식을 권장하시나요? 개인적으로는 cell counting 관련된 webinar도 igem 측에서 제공하여 진행하는 것이 나쁘지 않을 것 같습니다. — You are receiving this because you commented. Reply to this email directly, view it on GitHub <#23 (comment)>, or unsubscribe <https://github.com/notifications/unsubscribe-auth/ADNAUWSY7AMBDPLESNO7TI3UBB5CVANCNFSM5DUZ4BTQ> .

-- Professor | CSBL at Korea University | http://www.choilab.org | https://github.com/choilab Director | Institute of Life Science and Natural Resources, Korea University | http://lifenature.korea.ac.kr Chair | Department of Biotechnology, Graduate School | http://biograduate.korea.ac.kr Tel: 02-3290-3152 | Cell: 010-7448-3289

[2sungwook]

넵 조교님께 여쭤보고 의견을 따르겠습니다. 감사합니다!

[2sungwook]

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3314568/pdf/1471-2105-13-S4-S11.pdf
Anderson promoter J23101과 비교한 pLux 발현량(RFU). 플라스미드 카피 수(high, medium, low)에 따라 각각 3,5,8 배 정도 더 강함

[2sungwook]

Kill switch가 2.7 kb 여서 직접 합성해도 좋을 것 같습니다.
조교님께서 그 이후의 실험은 OD 또는 fluorescence plate reader 를 사용하여 세포수를 측정하는데,
OD를 사용할 경우 죽은 세포와 산 세포의 구분이 불명확할 수 있다고 하셨습니다.
Fluorescence 를 사용할 경우 실험이 어려울 것 같지는 않다고 하셨지만, 저번에 올려주신 논문을 읽어볼 필요는 있을 것 같습니다.
MazE,F reading frame 이 다른 것은 숨겨진 rbs가 있기 때문이고 박테리아에서 종종 발견되는 현상이라고 하셨습니다.

https://benchling.com/s/seq-AVQOh5GpwDrWd3QHL4vs
이 파트를 주문하여 실험을 진행해도 될 지 알려주시면 감사하겠습니다!

[igchoi]

특별한것은 없어 보입니다만, 시간이 없으니 진행하세요. IDTDNA 스폰서 계정신청은 했나요? 제가 8월말에 했는데, 아직 답장을 받지는 못했습니다. 2021년 9월 10일 (금) 오후 5:04, 2sungwook ***@***.***>님이 작성:

…

Kill switch가 2.7 kb 여서 직접 합성해도 좋을 것 같습니다. 조교님께서 그 이후의 실험은 OD 또는 fluorescence plate reader 를 사용하여 세포수를 측정하는데, OD를 사용할 경우 죽은 세포와 산 세포의 구분이 불명확할 수 있다고 하셨습니다. Fluorescence 를 사용할 경우 실험이 어려울 것 같지는 않다고 하셨지만, 저번에 올려주신 논문을 읽어볼 필요는 있을 것 같습니다. MazE,F reading frame 이 다른 것은 숨겨진 rbs가 있기 때문이고 박테리아에서 종종 발견되는 현상이라고 하셨습니다. https://benchling.com/s/seq-AVQOh5GpwDrWd3QHL4vs 이 파트를 주문하여 실험을 진행해도 될 지 알려주시면 감사하겠습니다! — You are receiving this because you commented. Reply to this email directly, view it on GitHub <#23 (comment)>, or unsubscribe <https://github.com/notifications/unsubscribe-auth/ADNAUWXSWGS4J7OCFD4HROLUBG3ZTANCNFSM5DUZ4BTQ> .